背景介绍
客户需在酵母中构建了一个四基因代谢途径，将底物转化为小分子药物前体。 前期将四个基因非别置于四个组成型启动子的控制之下，然后将整个途径置于酵母菌株的低拷贝数质粒中，但最终构建的菌株的目标前体产量远达不到商业化生产水平。 为提高产量，客户决定在保证启动子不变的情况下针对每个催化反应的酶进行优化。
客户要求在低拷贝数载体中构建分别由四个组成型启动子启动的四基因代谢途径。 为了提高产量，优化合成通路，通过检索数据库和文献查找到每种基因的五十种变体。随机将这些基因变体插入该途径的每个编码DNA序列（CDS）位置，理论上形成的文库大小为6250000。
将所有突变体DNA片段和载体骨架片段放入一个组装反应体系中进行组装，然后转化E. coil细胞形成一个混合文库。 随机挑选2,000个单菌落并PCR验证四个目的基因片段是否成功插入，结果显示阳性率超过80％。 将所有PCR检测结果为阳性的克隆经过培养后均采用高通量平台进行小量制备，然后将质粒转化至酵母细胞中以进行性能测试和筛选。
随机挑选48个阳性克隆进行测序分析， 测序结果显示文库多样性达100％且文库组装的偏差性很小。
筛选所有阳性克隆的性能后，选取性能最好的96个克隆进行测序。 在性能良好的克隆中，某些基因变体的富集度明显高于其他变体。 这些性能表现良好的变体可以在下一轮优化中进一步进行组合测试。
