FAQ: CRISPR实验关键试剂的选择
Q6. 化学合成的sgRNA与利用体外转录（IVT）sgRNA有什么区别？
化学合成sgRNA主要有以下优势：
- 编辑效率高：研发和Nat. Biotechnol等文献均发现化学合成sgRNA的编辑效率高于体外转录sgRNA；
- 细胞毒性低：体外转录sgRNA带有5'三磷酸修饰，会引起细胞免疫反应，造成细胞毒性，干扰后续实验，而化学合成的sgRNA则不存在该干扰因素；
- 更稳定：化学合成sgRNA可添加硫代和甲氧基修饰，使其在储存和试验中更稳定，且化学合成工艺的稳定性和一致性优于生物合成，可以保证下游实验的可重复性；
- 操作简单：化学合成sgRNA即买即用，体外转录sgRNA需要2-3 天、5-6步合成操作，经济和时间成本高。
Q7. 使用合成sgRNA与使用crRNA:tracrRNA双链体有什么不同？
使用 sgRNA 时，无需在使用前对crRNA和tracrRNA双链体进行退火。更重要的是，几项研究表明，当与 Cas9 共同作用时，长单链sgRNA 比 crRNA：tracrRNA 具有更好的稳定性，从而有更高的编辑效率1, 2。
- Hendel, et al., Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat. Biotechnol., 33 (2015) 985-989.
- Ryan et al., Improving CRISPR–Cas specificity with chemical modifications in single-guide RNAs. Nucleic Acids Research, 46 (2018) 2: 792–803.
Q8. gRNA序列应该如何设计？
设计您的 gRNA 序列包括 4 个步骤：
- 确定目标基因位点。
- 寻找适合gRNA靶向的序列。
- 检查脱靶结合的可能性。
- 选择位于结合区域内的gRNA序列。
通过提供脱靶评分和染色体位置，的gRNA数据库和在线设计工具将消除您在选择gRNA序列时的疑虑，建议使用3个gRNA序列，以确保敲除和实验准确性。
Q9. 进行CRISPR介导的基因KI时，如何从各种HDR模板中进行选择？我应该选择双链DNA、质粒DNA还是单链DNA？
这取决于实验目的和宿主细胞类型。与双链DNA供体相比，单链DNA表现出显著提高编辑效率和特异性，以及减少脱靶整合的优势，尤其是在编辑原代细胞、干细胞和开发转基因动物模型方面。
| 质粒DNA | dsDNA | ssDNA | |
|---|---|---|---|
| 敲入效率 | 中等 | 高 | 高 |
| 脱靶效应 | 中等 | 高 | 低 |
| 细胞毒性 | 高 | 高 | 低 |
| 成本 | 低 | 中等 | 较高 |
Q5. 为单链DNA模板提供哪些质量控制检测？
- Sanger测序，以确保单链DNA序列的准确性；
- 通过凝胶电泳对最终单链DNA产品进行纯度测试。
在单链DNA的生产过程中，我们进行了两轮测序，以保证序列的准确性。我们首先通过测序选择经过序列验证的质粒DNA模板，以确保最终单链DNA产品的纯度和序列准确性。此外，我们对最终的单链DNA产品使用直接测序来确认单链DNA产品的序列正确性。最终的单链DNA产品仅包含全长、经过序列验证的单链DNA分子。通过使用我们专有的、正在申请专利的酶合成方法，提供的单链DNA产品不含双链DNA。
